GPCRについて当社基盤技術アッセイ系検証FAQ

GPCRは医薬品の重要な標的

GPCR内訳GPCRの内訳

Nat Rev Drug Discov 2017;16:829-842

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)はヒトに約800種類あり、医学的、生物学的に極めて重要な細胞膜受容体群です(グラフ左)。嗅いや味を感知する感覚受容体が大半を占めるほか、血圧から血糖値、精神活動まで体の様々な機能を司る生理活性物質受容体が200種強、まだリガンドが知られていないオーファン受容体が約100種あります。

GPCRの中で生理活性物質受容体が医薬品の主な標的ですが、まだその一部しか承認薬の標的になっていません(グラフ右)。また最近の研究により、オーファン受容体や感覚受容体の中にも疾患に関わり医薬品の標的となり得るものが多くあることが分かってきました。

GPCR創薬の壁

GPCRs ranked by the number of targeting drugs
Drug Browser. GPCRdb.

しかしながら、限られたGPCRでしか医薬品開発が進んでいません。上の図は標的薬の多い順にGPCRを下から並べたグラフです。一番下のDRD2は承認薬と開発中の化合物をあわせて80種以上ありますが、上に向かうにつれ急速に標的薬の数が減少し、100番目以降のGPCRに対する薬はほとんどありません。比較的標的にしやすい一部のGPCR (low-hanging fruits) に対する医薬品開発、特に低分子薬の開発が進む一方、残りのGPCR (high-hanging fruits) の創薬にはなかなか手が届かない状況が続いていると言えます。

GPCR創薬の主な障壁のひとつは次の通り研究、創薬を支える優れたアッセイ系が存在しないことにあります。

  • GPCRの結合実験は偽陽性、偽陰性が多くあてにならない。
  • GPCR活性測定法の決定打がない。
    • レポーターアッセイ以外の活性測定法は高コスト、煩雑、HTSへの拡張が困難。例)Western blotting
    • レポーターアッセイで安定して活性を測定できるのは一部のGPCRのみ。特にG12/13、Gi/oシグナル検出の再現性、安定性が低い。

GPCR創薬の突破口

そこで当社はGPCR創薬の壁を打破し新薬開発を促進するため、全GPCRの活性を測定できる画期的技術を開発しました。

  • G12/13, Gi/oの壁を打ち破り、いずれのGαタンパク質と共役する受容体もアッセイ可能
  • オーファン受容体の活性評価も現実的に可能
  • これまでになく高感度、高S/B比
  • 低コスト、HTS化が容易
当社基盤技術:高感度網羅的GPCR活性アッセイに続く

高感度網羅的GPCR活性アッセイ

GPCR活性アッセイにはCa2+ アッセイcAMPアッセイβアレスチンアッセイ、レポータージーンアッセイなど様々な手法がありますが、共役するGαタンパク質のサブタイプにより使い分けねばならない、時間とコストが膨大に掛かるといった欠点がそれぞれにあり、決定打に欠けていました。網羅的で高感度高信頼性の当社アッセイ系はGPCR創薬の悩みを一気に解決します。

主な特徴

当社GPCR活性アッセイ系の主な特徴は次の通りです。

  • 圧倒的な感度、S/B
  • 業界最大規模313種のヒトGPCRの取り揃え
  • 主要Gαタンパク質に共役する全てのGPCRに対応
  • 作動薬、拮抗薬、逆作動薬、 PAMNAMを同定可能
  • 低コストでハイスループット化が容易
    • 1種類の汎用的な検定細胞を使用
    • 一般的な試薬と機器で測定可能
    • マイクロプレート上で受容体等を一過性に発現

GPCR活性アッセイ基盤技術

高感度で汎用的なアッセイ用細胞、 Gαタンパク質カクテル、全ヒトGPCRライブラリーから成ります。

試験用細胞

  • Gタンパク質下流シグナルを増幅する人工遺伝子回路を細胞に組み込み、これまでにない感度とS/B比を実現。主要なGαタンパク質に共役するあらゆるGPCRに対して従来の活性測定法より格段に高感度
    • G12/13共役受容体
    • Gi/o共役受容体
    • Gs共役受容体
    • Gq共役受容体
  • リガンド既知GPCRの99.1%で良好な応答を確認済( 218種中216種)
  • 受容体チロシンキナーゼ等GPCR以外の細胞膜受容体に拡張可能
  • 東京大学から国際特許出願中。当社に専用実施権設定予定

Gαタンパク質カクテル

Gαタンパク質3種のカクテル。試験用細胞に強制発現することにより、共役するGαタンパク質が不明なGPCRを活性評価可能にする、オーファン創薬の強力な武器。リガンド既知GPCR 218種で検証し95%の受容体で良好な応答を確認済。

全ヒトGPCRライブラリー

リガンド既知受容体218種、オーファン受容体95種を含むヒトGPCR 313種を網羅した業界最大級のライブラリー  (感覚受容体を除く)
一覧表と詳細情報

当社アッセイ系の検証

当社アッセイ系が多様な受容体に対し複数の既存試験法と整合性のある結果を出し、感度、S/B比が高いことが示されました。

AGTR1:ペプチド性リガンド受容体の例

当社アッセイ系で測定したAGTR1のアゴニスト応答は、既存試験法の結果と整合性があり、感度が高いことが示されました。

当社試アッセイ系

Tanso Biosciences' assay

既存試験法

結合実験

Nature. 1991;351:233-6.
LigandKi (nM) ± s.e.m.n
Sar1-angiotensin II0.38 ± 0.073
Sar1, Ala8-angiotensin II0.43 ± 0.083
Sar1, Ile8-angiotensin II0.46 ± 0.033
Ile7-angiotensin III1.1 ± 0.33
Angiotensin II1.6 ± 0.23
Angiotensin III5.4 ± 0.53
Dup7536.3 ± 0.93
Angiotensin I74 ± 123
Arg8-vasopressin>1,0002
Endothelin>1,0002
PD123177>10,0002
Competition binding profile of COS-7/Ba23.i401 membranes. Ki (nM) values were derived from the relationship Ki = IC50 ± (F/Kd). IC50 values were determined using the nonlinear regression, single-site competition curve-fitting function of Graphpad lnplot. F is the concentration in nM of radioligand added in each experiment and Kd is the affinity constant of [125I]sarile (0.68 nM) derived from saturation binding assays.

Inositol phosphate formation

J Biol Chem. 1995;270:12846-50. Inositol phosphate formation

Inositol phosphate formation by transfected wild-type AT1 receptor and the D281A mutant. Inositol phosphate formed in response to [Sar1] Ang II, [ Sar1,Gln2] Ang II and the non-peptide agonist, L-162,313, in COS 1 cells transfected with wild-type and the D281A mutant. The affinity constant (Ki) of wild-type and mutant D281A receptors, respectively, for [Sar1] Ang II is 0.32 nM and 83.2 nM, for [ Sar1,Gln2] Ang II is 52.7 nM and 304 nM, and for L-162,313 is 56.2 nM and 50.4 nM.

GPR91:低分子リガンド受容体の例

当社試験系で測定したGPR91のアゴニスト応答は、既存試験法の結果と整合性があり、感度が高いことが示されました。

当社試験系

Tanso's method

既存試験法

Ca2+アッセイ

Nature. 2004;429:188-93. Calcium assay

Flt3:受容体型チロシンキナーゼ (RTK) の例

当社アッセイ用細胞はRTK活性化にも応答し、その汎用性が実証されました。

当社試験系

GPCRのアッセイに用いたのと同じ試験細胞を使用し、GPCRと同じ方法でFlt3を一過性に強制発現しました。

既存試験法

Cell proliferation

Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein. R&D Systems Dose-dependent cell proliferation of Flt-3 expressing cells

Frequently Asked Questions

  • 人工遺伝子回路はノイズも増幅するのでないか?
  • 刺激依存的な細胞内シグナルは2乗のオーダーで増幅される一方、ノイズは2倍程度にしか増幅されないよう、人工遺伝子回路が設計されています。実際、多くのGPCRで100倍以上に達する良好なS/B比が得られ、マイクロプレートウェル間のばらつきが小さい範囲に収まっています(「アッセイ系検証」参照)。
  • タンソーバイオサイエンスのアッセイはbiased agonismを評価できるか?
  • Biased agonismは標的組織におけるGαタンパク質サブタイプの発現パターンに依存しているので、in vivo試験系が必要です。
  • アッセイ細胞のサブライセンスは可能か?
  • 現在のところ細胞の提供は行っていません。
  • タンソーバイオサイエンスの試験系でオーファンGPCRは細胞膜に発現しているか?
  • オーファン受容体は陽性対照が存在しないので、当社アッセイ系の信頼性を保証する上で膜発現の確認が重要なことを認識しています。各オーファンGPCRで検証を進めているところです。
  • ヒトGPCRを網羅していることは分かった。モデル動物の受容体はどうか?
  • マウスとラットのGPCRライブラリーを拡充中です。特定のGPCRについてご要望があれば優先的に対処し、約2週間でアッセイ体制を確立できます。

お問い合わせ

試験委託、共同研究のお問い合わせは info@tansobio.co.jp までお願いいたします。